Dados do Trabalho

Título

Avaliação funcional de mutação sítio-dirigida em aminoácido alvo na região CAP da Enzima Conversora de Angiotensina: expressão, purificação e análise da atividade proteolítica

Introdução

O controle da pressão arterial tem sido associado principalmente ao Sistema Renina Angiotensina Aldosterona (SRAA), este é responsável por grande parte da homeostase no organismo, através de uma cascata coordenada de processos enzimáticos, que envolve peptídeos, enzimas e receptores. A Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) se destaca pelo seu papel de gerar angiotensina II, a partir da angiotensina I. A ECA2 possui uma grande homologia em sua sequência com a ECA, os resíduos Glu395, His367 e His371 que coordenam a ligação com zinco, ou os resíduos Glu368, Tyr507 e His497 que são críticos na ação catalítica da ECA N-domínio, são inteiramente conservados entre as ECA somática, ECA porção N-domínio e ECA2. Além disso, as estruturas das ECA testicular e ECA N-domínio possuem forma elíptica, com a presença de uma fenda que divide o domínio em dois subdomínios (I e II). 

Objetivo

O objetivo deste projeto é estudar a importância dos aminoácidos conservados nesta região do entorno do sítio catalítico (região cap), região que se acredita ser determinante na interação do substrato/inibidor no sítio catalítico da enzima.

Método

Desta forma, foram realizadas mutações sítio-dirigidas nos resíduos alvo Ser11, Gln30, Arg53, Ser 61 e Gln 62, que foram alterados para Val, Ile e Ala. O cDNA do gene da ECA e as mutações propostas foram sintetizados e clonados em vetor ACE1 pcDNA 3.1(+), no sítio para BamHI e EcoRI, presente no sítio de múltipla clonagem do vetor. Posteriormente foi realizada purificação proteica por gel filtração e foi analisado o efeito das mutações com relação a atividade enzimática da ECA fazendo uso de substratos específicos de ECA, Hipuril-His-Leu e ZPhe-His-Leu.

Resultados

Foi obtida a expressão da enzima mutada na região de interesse (Ser11) e da enzima selvagem. Após o processo de purificação foi obtido um pool cromatográfico, que apresentou banda única em SDS-PAGE. Os valores das ECAs, foram semelhantes ao que foi encontrado nas amostras antes da purificação

Conclusão

A atividade enzimática do mutante sobre o substrato específico quando comparado a ECA selvagem foi semelhante demonstrando que esta mutação não afetou a capacidade catalítica da enzima. De modo geral, pode-se concluir que, após testes e adaptações, as metodologias utilizadas para a expressão heteróloga das ECAs (selvagem e mutante), assim como para a purificação proteica, estão corretas e devidamente padronizadas, o que permitirá o bom andamento das próximas etapas do projeto, que farão uso das enzimas puras.